弦華生物3S 無(wú)縫克隆試劑盒

貨號(hào):EV0070

英文名稱(chēng):3S Seamless Cloning Kit

產(chǎn)品規(guī)格:10T50T100T
【產(chǎn)品介紹】

無(wú)縫克隆技術(shù)（seamless cloning）作為一種高效、靈活的分子克隆方法，相較于傳統(tǒng)克隆技術(shù)具有顯著優(yōu)勢(shì)。無(wú)縫克隆技術(shù)通過(guò)簡(jiǎn)化操作流程、提高靈活性和效率，成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中替代傳統(tǒng)酶切連接操作的主流方法。其核心優(yōu)勢(shì)在于突破酶切位點(diǎn)限制、正確率及廣泛適用性，從而為涉及基因操作的基因表達(dá)、蛋白純化、基因編輯、合成生物學(xué)等領(lǐng)域提供了一種高效的研究工具。

本產(chǎn)品是一種即用型的無(wú)縫克隆產(chǎn)品。通過(guò)同源重組的方法，可以將目的DNA片段按照預(yù)定方向、快速、高效和精準(zhǔn)地插入到線性化載體中，并且最終構(gòu)建的克隆中不會(huì)引入任何額外的堿基序列。在任何載體中，反應(yīng)時(shí)間短至20分鐘，陽(yáng)性率可達(dá)到 95~100%。只需插入的 DNA 片段末端與載體末端具有 15~25個(gè)同源堿基序列就可以在載體的任意位點(diǎn)完成克隆重組。

【注意事項(xiàng)】（操作前仔細(xì)閱讀）

1. 重組反應(yīng)后的產(chǎn)物不可長(zhǎng)時(shí)間室溫放置，推薦-20℃保存；

2. 試劑盒重組效率較高，感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率>106 CFU/μg DNA即可，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積最多不應(yīng)超過(guò)所用感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10，即可以得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

3. 試劑盒中的含有陽(yáng)性對(duì)照載體和片段，請(qǐng)?jiān)谑盏皆噭┖泻箝_(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行測(cè)試。

【試劑盒組成】

【標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟】

1. 線性化載體和片段的制備

1.1 載體制備

1.1.1 線性化載體的獲得方式可以通過(guò)酶切或者反向PCR。

1.1.2 若通過(guò)酶切，請(qǐng)選擇合適的克隆位點(diǎn)，對(duì)載體進(jìn)行線性化。推薦盡量選擇無(wú)重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。

1.1.3 酶切時(shí)建議選用雙酶切。若選用單酶切，需延長(zhǎng)酶切時(shí)間或增加內(nèi)切酶使用量，以確保載體切開(kāi)，減少原載體殘留，從而提高鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性和正確率。

1.1.4 推薦對(duì)酶切或PCR制備的載體進(jìn)行膠回收，以提高純度。酶切處理的載體還可根據(jù)所用內(nèi)切酶失活條件進(jìn)行80℃ 10 min處理后直接進(jìn)行重組反應(yīng)，但需確保酶切。

1.2 插入片段制備

1.2.1 引物設(shè)計(jì)時(shí)，請(qǐng)?jiān)谝?'端加入包含酶切位點(diǎn)的15~25 bp堿基。引物由5'至3'分別為載體同源臂-酶切位點(diǎn)-基因特異性擴(kuò)增序列。注：若載體通過(guò)反向PCR制備，此時(shí)插入片段的引物序列中可不含上述酶切位點(diǎn)。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增推薦使用高保真聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 插入片段的回收可采用膠回收或?qū)⒎磻?yīng)液進(jìn)行DpnI處理以消化PCR模板。

2. 重組

請(qǐng)?jiān)诒吓渲靡韵路磻?yīng)體系，然后37℃反應(yīng)15~20min

2.1 重組反應(yīng)的插入片段與載體的用量為1：1~1：10（質(zhì)量濃度比）；

2.2 30℃延長(zhǎng)重組反應(yīng)時(shí)間至40分鐘，可提高重組效率，獲得更多克??；

2.3 重組后的體系，若不立即轉(zhuǎn)化，可在-20℃放置至多1周。

3. 轉(zhuǎn)化

   請(qǐng)將重組產(chǎn)物通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的化轉(zhuǎn)或電轉(zhuǎn)操作進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

弦華生物3S 無(wú)縫克隆試劑盒【存放說(shuō)明】

-20oC保存，至少一年有效。可以分裝后在-80oC長(zhǎng)期保存。